加熱塊均勻性分析

作者：文/ Andrew Birnie 本文作者供職于PCRmax公司。 文章來源：PROCESS制藥網(wǎng) 《制藥業(yè)》 發(fā)布時間：2015-12-10

圖 1 qPCR空心銀塊示意圖 (Eco 48 PCRmax)。該創(chuàng)新硬件具有穩(wěn)健的熱性能，能夠加速 qPCR 操作規(guī)程

新一代測序技術(NGS)憑借的數(shù)據(jù)吞吐率、可擴展性和速度使得研究人員能夠以的水平研究生物系統(tǒng)。現(xiàn)如今，基因組研究問題越來越復雜，除了傳統(tǒng)的DNA測序技術外，迫切需要更深入的信息支持。新一代測序技術地彌補了這一空缺，成為解決轉譯研究領域諸多問題的日常研究工具，例如臨床診斷、農(nóng)業(yè)基因組以及法醫(yī)學。

但是這同時也是挑戰(zhàn)。NGS 運行每失敗一次都將給實驗室?guī)砭薮蟮膿p失，事實上有時候造成的損失可以高達3000美元。

為了確保測序技術的成本效益并精簡流程提高準確性，實驗室需要確保不會讓缺乏性和均勻性的qPCR技術對運行造成破壞。這可能與所使用的儀器有很大關系。每一PCR系統(tǒng)中的多種因素，從溫度控制到光滲透，都會對每次運行的可靠性產(chǎn)生影響。通過實現(xiàn)*均勻性，制造商能夠確保每次運行*可靠且準確。

為了確保可靠性和準確性，商用儀器中也逐步采用創(chuàng)新型新技術。本文將介紹這些儀器(例如Eco 48實時PCR系統(tǒng)，PCRmax)如何在加熱塊中實現(xiàn)*的均勻性，以及其可靠性等級在工作實驗室范圍內(nèi)產(chǎn)生的影響。

圖 2顯示所有 48 個孔板數(shù)據(jù)的基線校正擴增圖。數(shù)據(jù)分析顯示平均 Cq 為 13.31，標準偏差為 ±0.061，而整個孔板的 %CV 僅為 0.46%，表示精度非常高

提高NGS技術性能

的DNA擴增是基因組研究的基本追求。同時，高吞吐率 NGS技術的研發(fā)也通常被視為過去30年生物科學領域革命性的創(chuàng)新之一。如今這一強度的技術已經(jīng)取代了以桑格測序為行業(yè)標準的傳統(tǒng)PCR技術，例如毛細管和凝膠技術。

NGS技術能夠使研究人員同時處理百萬條多量級的平行 DNA 序列，速度比傳統(tǒng)測序技術更快。但是NGS的成本依然很高;一套商用NGS系統(tǒng)的價格大約在15萬~100萬美元之間，同時驅動這些流程的成本也非常高。因此，方法研制的關鍵便在于優(yōu)化每次運行的條件，將故障風險降至zui低，實現(xiàn)zui大化。目標庫定量已被視為能夠利用成本有效性技術從而簡化NGS工作流的領域。

NGS流程需要制備目標庫，并且在該庫中靶分子片段將與銜接子相融合，隨后通過聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增和測序。zui終庫中目的DNA片段的大小將成為構建NGS庫的關鍵參數(shù)。如果 NGS平臺上加載的模板過少，運行的效率將非常低。如果平臺上加載的模板過多，那么不僅會導致效率低下，還會增加*失效的可能性。因此穩(wěn)健且可靠的庫定量非常關鍵。

圖 3顯示孔板中 48 個孔數(shù)據(jù)的標稱熔點曲線。100bp PCR 產(chǎn)物在 75~95?℃ 范圍內(nèi)熔化，Eco 48以0.1?℃的溫度變化測量熒光性，IV 級 SNP 的檢測精度需要超過 99%

定量PCR(qPCR)是NGS庫定量可選的技術之一。但是，并不是所有的PCR系統(tǒng)均能夠帶來足夠的熱均勻性，滿足NGS系統(tǒng)安全加載所需的高重復性和度。此外，冗長的qPCR操作規(guī)程會嚴重影響整個NGS運行的效率。由于一次失敗運行所損失的成本超過了高性能qPCR儀器的價格，因此采用穩(wěn)健的定量qPCR技術被視為實現(xiàn)一致NGS的zui簡單且成本效益的方式之一。

圖 4(A和 B)：孔板48個孔的Cq和Tm數(shù)據(jù)概覽。所有48個樣本的記錄zui大變化為0.24個周期，整個孔板的Tmzui大范圍為 0.2?℃(84.3~84.5?℃)

選擇正確的 PCR 技術

qPCR可以監(jiān)控退火流程期間熒光引物的排放物，從而可以監(jiān)控鏈擴增。為了在適當?shù)姆磻A段進行定量分析，將實時捕獲熒光信號。這可以克服傳統(tǒng)、半定量端點檢測產(chǎn)生的相關不性，包括樣本之間PCR效率的不明變化以及回推起始量時產(chǎn)生的誤差。

溫度控制是qPCR技術的核心所在;其將決定引物能否有效結合以及聚合酶能否起到*效果。為了實現(xiàn)高準確度，實時 PCR熱系統(tǒng)必須確保整個加熱快的溫度均勻性，確保能夠以相同速率的反應處理所有的樣本。但是，標準qPCR系統(tǒng)在50~60?℃溫度范圍內(nèi)的熱準確性只有大約 ±0.5?℃。通常這不足以地定義聚類密度，并且如果qPCR平臺低于或超過實際庫濃度時，NGS 運行可能會面臨故障風險。對于 qPCR實驗，嚴格的MIQE(定量實時PCR試驗發(fā)布的zui低限度的信息)指南強調(diào)了精度的重要性，需要采用靈敏度更高的qPCR技術。

傳統(tǒng)qPCR系統(tǒng)采用珀耳帖熱保溫塊來驅動熱循環(huán)。加熱這些實心塊的整個表面數(shù)據(jù)能量密集型流程。在平衡至穩(wěn)定時期之前，大多數(shù)基于珀爾貼的系統(tǒng)會超過所需的反應溫度。加熱塊范圍內(nèi)所有孔達到該點所需的時間將延長運行時間。更重要的是，這種加熱方法會導致較高的熱不均勻性(TNU)，數(shù)值為±0.5?℃，并導致較差的升溫斜率。不準確和效率低導致傳統(tǒng)的實心塊qPCR 無法適用于高性能應用。

qPCR加熱技術的發(fā)展克服了上述難題。現(xiàn)代系統(tǒng)利用*均勻的空心銀塊，其中將流經(jīng)導電流體。使用單一的珀爾貼設備來加熱和冷卻流體，隨后流體通過反向攪拌器將在所有的樣本孔中均勻循環(huán)。這可以確保穩(wěn)健的熱性能，使得95?℃條件下的 TNU值低于±0.1?℃，從而可以縮短運行時間。使用該系統(tǒng)的標 40循環(huán)PCR操作規(guī)程大約需要40?min的時間才能完成，而優(yōu)化后的流程只需要15 min的時間便可完成。

熒光監(jiān)測技術取得的發(fā)展改善了qPCR技術的性能。高性能光學系統(tǒng)使得能夠在一次反應中實時監(jiān)測多達四種目標物，并且先進的探測器陣列能夠監(jiān)控源自所有孔的熒光，允許系統(tǒng)記錄每個孔、過濾器和周期，不會遺漏任一數(shù)據(jù)點。zui終，利用穩(wěn)定的發(fā)光二極管(LED)幫助生成準確的數(shù)據(jù)，可以延長儀器使用壽命，降低折舊成本。

下列案例研究說明了加熱塊熱均勻性的改善是如何帶來高性能NGS應用所需的靈敏度、精度和整體效率。

案例研究：提高 qPCR 精度

48個復制樣本通過PCRmax Eco48進行高分辨率熔解(HRM) 操作。HRM 確保能夠對遺傳變異進行準確地分析，例如量化單核苷酸多態(tài)性(SNP)，就精度而言是需熱量zui大的操作規(guī)程之一。

48個樣本孔中的每一個都注滿了 1×10 8個起始模板的副本，zui終體積為10?ul?？装暹M行了密封，并在12?000 rpm 條件下進行離心分離1?min，未優(yōu)化40循環(huán) PCR 操作規(guī)程的總體完成時間為 43min。使用源自 Promega 的 GoTaq® QPCR GoTaq® QPCR Master Mix (2x)(產(chǎn)品代碼 A6001)對模板進行擴增處理，用于40次循環(huán)。在60?℃操作結束時將收集熒光光譜數(shù)據(jù)。使用生態(tài)研究軟件分析結果，以確定定量循環(huán) (Cq)、熒光檢測點以及48個復制品中每一個的解鏈溫度 (Tm) 值。

圖 2 顯示了所有 48 個孔的基線校正擴增圖譜。該圖清晰展示了整個孔板的擴增精度。數(shù)據(jù)分析顯示平均 Cq 為 13.31，標準偏差為 ±0.061。這意味著整個孔板的變異系數(shù) (%CV) 僅為 0.46%，表示精度非常高。 PCR產(chǎn)物擴增后運行熔化階段，借此來確定 Tm，而Tm是確定加熱塊均勻性zui有效的衡量標準之一。擴增產(chǎn)物在75~95℃范圍內(nèi)熔化，Eco 48以0.1℃的溫度變化為變量來測量熒光性， IV級 SNP的檢測精度需要超過 99%。圖 3 顯示了標稱熔點曲線。所有 48個孔板的平均 Tm 為 84.45℃，標準偏差為 ±0.058，相當于整個孔板的%CV 僅為0.07%。這說明加熱塊的溫度均勻性非常*。圖4A和4B概述了該實驗的結果。

推動基因組學未來發(fā)展

采用熱準確性的系統(tǒng)能夠提高所有PCR應用的分析生產(chǎn)率。但是，人們越來越認為更大程度的溫度控制會給用戶在NGS 流程期間造成更大的成本，這就使得高性能qPCR成為例行測序的關鍵特點。采用創(chuàng)新加熱塊技術的qPCR儀器，例如PCRmax Eco 48，可以在40??min內(nèi)完成熱均勻性和快速循環(huán)，每次溫度變化后，整個加熱塊立即會發(fā)生±0.1℃ 的均勻性變化。